如何成为专业的生信人，那就是搞到质量高的测序数据。在各大测序数据库中，作者往往不会将自己整理好的数据直接上传，而是放一个raw data。那我们下载下来是无法直接使用的，需要进行专业处理拿到基因表达矩阵。今天分享一个GEO数据库上载录的于2020年发表的人RNA-seq测序数据，并教大家如何处理。

演示数据获取网址如下

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE114517

（1）可以发现作者这里仅提供了两个文件：一个是处理好的差异分析csv文件，这作者好的有点离谱；一个是原始数据压缩包，这才是基本操作。

小贴士：在GEO 数据库的下载栏中，FTP 和 HTTP 是两种用于下载数据的协议。

1.FTP（File Transfer Protocol）：通过FTP 下载数据时，会提供一个 FTP 地址，用户可以通过工具连接到 GEO 的服务器并下载文件。适合大文件或批量下载。需要使用支持 FTP 的客户端（如 FileZilla）或命令行工具（如 wget）进行下载。

2.HTTP（Hypertext Transfer Protocol）：点击链接即可在浏览器中直接下载文件。

3.custom和http是一种下载格式，只是custom支持单样本数据下载。

（2）那我们这里直接去下载处理好的差异分析csv文件，看看文件长什么样子，是不是我们想要的。结果根本打不开这个文件，真是资本家啊。

（3）只能改道去下载原始数据压缩包。点击http，下载全部数据。

（4）将下载的压缩包进行解压缩

（5）点击进入文件，发现每个样本的txt单独压缩成文件。

（6）一一打开这些文件后，发现这些txt格式一致：第一行是基因的ENSG名称，第二行是FPKM。下面我们要做的就是合并这些文件，形成一个第一行是样本，第一列是基因名，其余是基因表达值的基因表达矩阵。

（7）运行下述代码即可获得基因表达矩阵，注意设置R语言路径为解压后的GSE114517_RAW文件夹。

（8）运行代码后将获得基因表达矩阵的csv文件。接着运行R代码对基因名进行转换。

（9）打开代码运行后保存的文件，可以看到样本名称已经分开，并依次填充到后面单元格，与基因表达值一一对应；基因探针为第一列。现在只需要手动删除第一行，并将A2单元格NA改成Gene Symbol。

（10）现在使用R将基因探针对应成基因名称

（11）上面获得的基因转换内容复制并插入表达矩阵中，并用函数索引进行基因的填充替换。黄色为原基因探针，橙色为复制内容，GENE栏为将要填充的基因探针对应的基因。

（12）非常重要的步骤！另外，需要注意，原始GEO下载的数据中基因名称后面有小数，那是更新的版本号。需要要选中A列，运行函数（=MID(A2,1,15)）仅取前15位数字，CTRL+D进行填充，这样就可以获得正确的ENSG了。然后复制插入正确ENSG列，格式仅数字，再删去原先两列。而R语言处理基因名称转换时候，我们已经用代码处理过了，只需要按代码运行转换基因名称时就不会报错。

（13）使用VLOOKUP函数进行基因名称的转换，公式：

=VLOOKUP(A:A,B:D,2,FALSE)。

然后选中这一列CTRL+D进行填充，补全公式。

（14）将GENE这一栏复制为仅数值插入右侧。

（15）删除前5列即可得到完整的基因表达矩阵。

（16）将GENE栏按升序排列。

（17）下拉到基因名为N/A的地方并删除。出现基因为N/A的原因是由于基因探针与GENE名称的对应关系在不断变化，或者每个测序公司有非公用探针。这种时候只能忽略这些值，或者更新自己的R包，或者联系文章作者。

（18）最后，将样本名更改成正常和疾病。回到GEO数据库中查看每个样本代表的是正常还是疾病。可以发现Cont是正常，PD代表发病。

（19）在基因表达矩阵中更改样本信息。

（20）新建一个CSV文件，将样本信息归组，用于后续差异基因分析用。

（21）按照R代码运行，以 logFC 为 1、 P.Value 为 0.05 为筛选目标进行差异基因分析。

（22）保存后的差异基因中注明了每个基因是上调还是下调。

（23）利用差异基因绘制火山图。

（24）火山图展示图。

（25）在火山图上添加基因。

（26）读入基因表达矩阵，绘制热图。

（27）热图展示图。

（28）利用差异基因进行功能富集分析。可以使用上调、下调、上调+下调或自定义基因进行分析。将需要分析的基因按图所示的格式保存为CSV文件。

（29）运行代码分析GO/KEGG。

（30）GO/KEGG功能富集分析展示图。